PCR反应中Taq酶最适温度为75度,为什么把仪器设为72度?

这种情况下需要先使用第一种方法混匀再分装，保证每管中的PCR体系相同，再寻找其他原因。4. 梯度PCR不是以1度为梯度的PCR，如果你用梯度PCR设计梯度的话，你会发现，随着你设置的退火温度范围不同，每个梯度温度都会有改变，而且是不规律的，这都是仪器自己设定的，你可以根据自己的实验需要调整温度范围...

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；2、一般都是相对量，则用deltadeltaCT方法来计算；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们...

Taq DNA聚合酶是最常见、历史最悠久的类型，具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，但缺乏3’-5’校正活性。其耐热性良好，无需中途添加酶，但保真性较低，主要依赖于镁离子和dNTPs的浓度和比例。Tth DNA聚合酶耐热性更优，适用于高GC含量的PCR反应，对抑制成分的耐受性更强。它具有RTase...

DNA聚合酶和DNA连接酶都是形成磷酸二酯键，但两者不同之处是：DNA聚合酶催化单个脱氧核酸聚合，且需要有模板；而DNA连接酶是将两个DNA片段之间连接。RNA聚合酶，催化转录形成RNA的酶，将单个核糖核苷酸聚合，也是形成磷酸二酯键。限制酶是断裂磷酸二酯键。解旋酶是使氢键断裂。

Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR...

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而...

2、退火；使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3’方向复制出互补DNA。PCR过程中需要注意：1、Taq DNA 聚合酶：Taq 酶种类有很多，...

4、操作多份样品时，制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作，避免污染，可以增加反应的精确度。5、最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。6、操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性。7、尽可能用可替换或可高压...

梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和...

6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体；8. 增加循环数；9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，...