质粒和目的基因片段分别双酶切(bamh1,xba1)连接后电转感受态细胞,同时...

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。（...

你可以询问实验室其他人员，看看酶是否有问题，感受态是否有问题，抗生素是否有问题，等等 按你给的线索，菌落很少，很有可能是切开的线性质粒没有连上片段，转不进细胞，少量没有切开的空载体转进细胞，形成阴性菌落。问题可能在片段酶切上，建议连T载体再切，或双酶切换成两步单酶切，或换酶切位点...

切出来的带就是56bp也是可以看到的，比如一般的引物二聚体不过就30bp左右也可以看得很清楚，如果电泳没有看到，那是酶切没有成功、或者效率太低（不足以做后续的连接反应）。

切割后能产生相同的黏性末端，末端彼此间可以发生碱基互补配对，从而形成重组DNA分子。所以当用两种不同限制酶也就是双酶切，分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，能够防止发生目的基因与质粒自身连接体，充分克服单酶切的缺点。但由于每种限制酶作用的条件不同，两种酶不能同时使用的意思，只是为了保证酶的...

（1）用不同类型的限制酶切割dna后，可能产生两种类型的末端，即黏性末端或平末端．若要用限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择相同的限制酶，以切割产生相同的黏性末端．（2）构建的表达载体含有目的基因（人胰岛素基因）、标记基因、启动子及终止子等，其中启动子、终止了也是一段dna...

3正常情况下可以显现出大小不等的两条带，双酶切将整个环状DNA切成两个片段。4可能其中一个酶质粒上有2个酶切位点，或是因为酶切不彻底，部分质粒没有被双酶切（大片段，小片段，和单酶切得出的片段，因片段大小不一呈现出三条带）。5质粒上有多个关于这两个酶的酶切位点，即酶切不专一，从而...

用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有2种不同DNA片段．（2）为了提高试验成功率，需要通过PCR技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝．该方法也是检测遗传多样性的最简单方法．（3）由图1可知，目的基因两侧是GGATCC序列，该序列是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将质粒和目的基因D连接形成重组质粒，应...

第一次沉淀：250ml冰冷的水 第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇 第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇 最终的OD600应为约200 7）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪...

（1）限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种．若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生相同黏性末端的限制酶．（2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动...

不利于转化，因为此时质粒只是附着在细菌表面，但还没有进入细菌，而你放过夜，细菌上的通道可能大多数都关上了（感受态只有在刚做出来时可以放四度24小时，以后就得放-70了）。经过热激后，质粒已经被吞进去了，再放四度过夜没有大的问题。